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實(shí)時熒光定量PCR在檢測上主要應(yīng)用這兩個方法
更新時間:2022-08-22   點(diǎn)擊次數(shù):620次
  實(shí)時熒光定量PCR在檢測上主要應(yīng)用這兩個方法
  實(shí)時熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
  PCR是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號,對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。
  所謂實(shí)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
  檢測方法:
  1、SYBRGreenⅠ法:
  在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。
  SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
  PCR產(chǎn)物熔解曲線圖
  2、TaqMan探針法:
  探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。
  技術(shù)原理:
  將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后,完成高溫變性,低溫復(fù)性,適溫延伸的熱循環(huán),并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律,與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷,熒光素游離于反應(yīng)體系中,在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光,隨著循環(huán)次數(shù)的增加,被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長,通過實(shí)時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度,求得Ct值,同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照,即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。
 

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