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病毒的超低溫保存法
更新時間:2013-01-07   點擊次數(shù):1426次

 概述

 
大多數(shù)微生物可用超低溫保存,超低溫保存法是適用范圍zui廣的微生物保存法。需要復雜營養(yǎng)的微生物種,如用其他的貯存方法不能保持其活力( 如植物的病原性真菌),通??捎贸蜏氐姆椒ū4妫ˋTCC 1983;Halliday,Baker 1985)。此法是將凍存在小管或安瓿里的細胞以較慢的冷凍速率(1℃/分鐘)冷凍,直至—150℃,再將這些小管貯存在-150~-196℃的液氮中。
 
超低溫的冷凍保護劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油(10%)、二甲亞砜(5%)和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細胞株。這些化學試劑進入細胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷。
 
貯存在低溫容器內(nèi)的細胞復蘇時必須小心操作。當小管被加熱時,所形成的冰晶會將細胞殺死,正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失,做法是:將封口的小管迅速放入37℃的水中,直至所有的冰融化,然后打開管口,將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。
 
超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中,因此需要液氮罐。在長期貯存的過程中必須經(jīng)常注意補充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費,包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等。
 
材料
 
病毒超低溫保存所需材料有:熱收縮塑料管(Nunc Cryoflex),液氮罐,防護手套和面罩,*性記號筆,氣體噴燈,裝液氮的保溫瓶。
 
方法
 
(1)剪一段兩端各超出冷凍管長度2cm 的熱收縮塑料管。
 
(2)將含有澄清病毒懸液(組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基,或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細胞溶解產(chǎn)物均可)冰浴幾分鐘,用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi),并將蓋子擰緊。
 
(3)將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部,插入正確的標簽。
 
(4)用噴燈小心加熱熱收縮塑料管,并使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。
 
(5)再小心加熱熱收縮塑料管的兩端,用大號鑷子夾緊管的端口至*密封。
 
(6)將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍(操作時要求戴面罩和手套)。
 
(7)將冷凍過的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi),同時記錄樣品的詳細的存放位置、實驗編號和存放日期等。
 
(8)需要用時,迅速從液氮罐內(nèi)取出所需樣品,并投入37℃水浴箱中解凍后,用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開熱收縮塑料管。擰開冷凍管的蓋子時不需要除去熱收縮塑料管。
 

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