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DAB染色后切片著色一片黃的解決方案
更新時間:2015-11-11   點擊次數(shù):2615次

解決方案:

    以上的分析可能對于初學者還是不容易的,下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說,著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的,由于用SP法已經(jīng)做出來過一次且效果不錯,因此對于同樣組織的同一抗原進行分析,這種因素可以先排除。

2、其次,DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min,后來也是8-10min,我單獨做了一次實驗來排除該因素。結(jié)果孵育2.5min時先出現(xiàn)背景,而特異性染色較淺,故這不符合常理,一般先出現(xiàn)特異性染色,然后隨著時間的延長,會出現(xiàn)非特異性背景著色。

3、zui后,血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min,所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h,其它條件同做出來的那一次,結(jié)果也一樣背景著色很深。

4、此外,我在改進的同時,也對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數(shù),甚至*參照試劑盒說明書來進行操作,以及過氧化氫滅活加強等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個實驗流程,與*次做出來相比,只有兩個地方做了改動:因血清不夠而更換了不同試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體,自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩(wěn)定劑),其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內(nèi)剩余的一點),奇跡出現(xiàn)了:結(jié)果很好。——因為抗原抗體反應(yīng)除溫度、抗原/抗體濃度外,然后就是PH值,于是我測了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值,結(jié)果是前者偏酸性(<6.0),而后兩者均在7.5左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問題了,于是我又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內(nèi)的試劑對組織切片做了免疫組化,結(jié)果還是沒有做出來:背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細分析:一抗一定是結(jié)合上去了(老SP試劑盒結(jié)果很好),問題是二抗沒有結(jié)合上去也不對(因為zui后背景很深,這說明二抗可能也結(jié)合上去了),DAB孵育時間現(xiàn)在只用1.5min也是背景深而特異性染色淺,那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩張切片:一張用老試劑盒內(nèi)還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內(nèi)的封閉血清,其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的,結(jié)果是前一張效果很好,而后一張能夠看到特異性染色,但背景太深,拍照效果不佳。——看來封閉血清也是罪會禍首之一。

 

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