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免疫熒光組織化學(xué)染色法
更新時(shí)間:2015-11-18   點(diǎn)擊次數(shù):1807次

(一)免疫熒光組織化學(xué)原理

    將已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受到激發(fā)光的照射會(huì)發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),熒光素受激發(fā)光照射,由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài),而高能態(tài)的電子不穩(wěn)定,以輻射光量子的形式釋放能量后,再回到原來(lái)的低能態(tài),這時(shí)發(fā)出明亮的熒光。利用熒光顯微鏡可觀察熒光所在細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

(二)熒光抗體染色法

1.直接法

(1)染色:切片經(jīng)固定后,滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)的熒光抗體,在室溫或37℃染色30min。切片置入濕盒內(nèi),防止干燥。

(2)洗片:倒去熒光抗體,將切片浸入pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗兩次,電磁"振動(dòng),每次5min,再用蒸餾水洗1min,除去鹽結(jié)晶。

(3)50%碳酸鹽緩沖甘油(O.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH 9.O~9.5)封固、鏡檢。

直接法相對(duì)簡(jiǎn)單,適用于細(xì)菌、螺旋體、原蟲(chóng)、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗體如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)抗原,特異性高而敏感性相對(duì)低。

2.間接法(雙層法)

(1)切片固定后用毛細(xì)管吸取適當(dāng)稀釋的免疫血清滴在其上,置于濕盒中,37℃作用30min。用O.01mol/LpH 7.2 PBS洗滌兩次,每次5min,用濾紙吸去多余液體。

(2)再滴加問(wèn)接熒光抗體(如兔抗人γ一球蛋白熒光抗體等),同上步驟,37℃染色30min,PBS洗滌兩次,每次5mirt,振動(dòng),緩沖甘油封固,鏡檢。

3.間接法(夾心法)

(1)切片或涂片固定后,置于染色濕盒內(nèi)。

(2)滴加未標(biāo)記的特異性抗原與切片作用于37℃,30min。

(3)PBS緩沖液洗滌2次,每次5min,吹干。

(4)在切片上滴加特異性熒光抗體,37℃,30 min。

(5)PBS緩沖液洗滌兩次,每次5min,吹干。

(6)緩沖甘油封固,鏡檢。

4.補(bǔ)體方法

(1)材料和方法

1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers;鹽水作2倍稀釋,為1:2,1:4,1:8…補(bǔ)體用10倍稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補(bǔ)體熒光抗體等,按下述補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合效價(jià)如為1:32,則免疫血清應(yīng)用l:8倍稀釋。

2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作l:10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果,按兩單位的比例,用K。lmers鹽水稀釋備用。

Kolmers鹽水配制是在pH7.4的0.1mol/L PBS中溶解MgSO4,其終濃度為O.01%。

3)抗補(bǔ)體熒光抗體:在免疫血清效價(jià)為1:4,補(bǔ)體為兩單位的條件下,用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),然后按染色效價(jià)1:4的濃度用Kolrners鹽水稀釋備用。

(2)方法

1)涂片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗滌一次,約3min,吹至組織表面無(wú)水分。

2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清及補(bǔ)體的等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都各稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于濕盒內(nèi)。

3)用PBS緩沖液洗滌2次,攪拌或振動(dòng)混勻,每次5m·n,吸于標(biāo)本周圍水分。

4)滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的抗補(bǔ)體熒光抗體,37℃作用30min,水洗同上。

5)蒸餾水洗滌lmin,緩沖甘油封固。

5.膜抗原熒光抗體染色法

用直接法或間接法原理及步驟,可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色,常于T和B細(xì)胞、細(xì)貔培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的研究,陽(yáng)性熒光主要在細(xì)胞膜上。

6.雙重染色方法

(1)一步法雙染色法:先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合(A+B),按直接方法進(jìn)行姿色。

(2)二步法雙染色方法:先用RB200標(biāo)記的B抗體染色,不必洗去,再用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記的A抗體染色,按間接法進(jìn)行。

(3)結(jié)果:經(jīng)FITC標(biāo)記的A抗原陽(yáng)性熒光呈現(xiàn)綠色,經(jīng)RB200標(biāo)記的B抗原陽(yáng)性呈現(xiàn)橘紅色熒光。

(三)熒光抗原染色法

    某些抗原可用熒光素標(biāo)記,制成熒光抗原,標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同:用熒光抗原可直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體,特異性較好,敏感性較差。染色方法與熒光抗體染色的直接染色法相同。由于多數(shù)抗原難以提純或量少昂貴,一般很少采用此法。

 

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